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本产品是用于细胞或组织切片免疫荧光染色的试剂盒，含有Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG(H+L)抗体，可以用于检测兔来源的相应一抗，在激光共聚焦显微镜下可以观察到非常明亮的远红外荧光。

本试剂盒提供了含有荧光标记抗体稳定剂的免疫荧光染色二抗稀释液，可以确保荧光标记抗体稀释后在4℃可以保存长达6个月，并且在6个月内至少可以重复使用10次。本试剂盒含有抗荧光淬灭封片液，可以使荧光更加持久。

Alexa Fluor 647是一种较常用的非常明亮的远红外荧光探针。通常该荧光探针被激发后肉眼不能观察到激发出来的长波长荧光，但可以被很多成像系统例如激光共聚焦显微镜等所检测到。Alexa Fluor 647的荧光光谱与Cy5比较接近。Alexa Fluor 647的吸收(激发)和发射峰参见下表。

• 需荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
  
• 在使用抗荧光淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍宜尽量避光，特别是需要尽量缩短在荧光显微镜下的观察时间。
  
• 荧光物质均易发生淬灭，染色后宜尽快进行荧光显微镜下的观察。如果不能及时观察可以4℃避光保存，但存放时间通常不宜超过一周，随着存放时间的延长可能会导致观察效果越来越差。
  
• 免疫荧光染色效果的好坏和一抗的关系非常密切。建议选购有较多文献报道的并注明可以用于免疫荧光染色的一抗用于本实验。
  
• 如果观察时发现荧光过弱，可以适当提高一抗的浓度；如果荧光还是比较弱，可以适当提高荧光标记抗体的浓度。
  
• 需自行配制用于免疫荧光染色的相关试剂，需自备盖玻片和载玻片。

• 免疫荧光染色的准备工作：
  
  • 固定液的准备：
    推荐使用百奥莱博的免疫染色固定液(货号：YT086)，也可以用4%多聚甲醛作为固定液，或根据特定的一抗或样品采用有效成分为乙醇、甲醇或其它类型的固定液。
    
  • 洗涤液的准备：
    推荐使用百奥莱博的免疫染色洗涤液(货号：YT089)，也可以按照如下方法配制TBSTx作为洗涤液：
    10×TBS的配制：称取24.2g Tris (Tris碱),80g NaCl；用盐酸调节pH值至7.6，定容至1L。
    TBS配制：把10×TBS按照1:9的比例用水稀释至1X即为TBS。
    TBSTx的配制：在TBS中加入Triton X-100使最终浓度为0.1%，混匀，即为TBSTx。
    
  • 封闭液的准备：
    推荐使用百奥莱博的免疫染色封闭液(货号：YT087)，也可以按照如下方法配制含5%BSA的TBSTx作为封闭液：
    含5%BSA的TBSTx的配制：在100mL TBSTx中加入5克BSA，溶解并混匀，即为含5%BSA的TBSTx。
    
  • 一抗稀释液的准备：
    推荐使用百奥莱博的免疫染色一抗稀释液(货号：YT088)，也可以使用上述封闭液，即含5%BSA的TBSTx，作为一抗稀释液。
    
  • 一抗的稀释：
    按照一抗说明书中推荐的用于免疫荧光染色的稀释比例用一抗稀释液稀释一抗。
    
  • 荧光标记二抗的稀释：
    把荧光标记的二抗，按照1:1000的比例用本试剂盒提供的免疫荧光染色二抗稀释液进行稀释。根据荧光的强弱，稀释的比例可以适当提高或降低。
• 对于贴壁细胞：
  
  • 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9% NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%～80%满。
    
  • 按照特定的实验目的处理细胞后，吸尽培养液，加入1mL固定液，固定10分钟或更长时间(可4℃固定过夜)。
    
  • 去固定液，用洗涤液洗3次，每次3～5分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。
    
  • 用封闭液封闭60分钟，可以在摇床上轻轻摇动。
    
  • 去封闭液，用稀释的特定一抗作用60分钟，可以在摇床上轻轻摇动。为增强与一抗的结合，可以4℃作用过夜。
    
  • 去除一抗，用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5分钟。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。
    
  • 去除洗涤液，加入1mL稀释好的荧光标记的二抗避光孵育60分钟，可以在摇床上轻轻摇动。
    
  • 回收荧光标记的二抗，用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5分钟，期间适当注意避光操作。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。
    
  • 滴一滴本试剂盒提供的抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。
    
  • 如果一抗选用适当，在激光共聚焦显微镜下可以观察到远红外荧光。
• 对于悬浮细胞：
  
  • 离心收集细胞样品于1.5mL离心管内，吸除上清后轻轻弹散细胞。
    
  • 加入0.5mL固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。
    
  • 离心去固定液，用洗涤液洗3次，每次3～5分钟。洗涤期间可以用手或摇床轻轻晃动。
    
  • 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50μL液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。
    
  • 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。如果条件许可，可以使用适当的离心机，通过离心把细胞贴紧在载玻片上。
    
  • 用封闭液封闭60分钟。封闭及后续的操作可以用百奥莱博的染色缸和染色架或邮寄夹进行操作。
    
  • 去封闭液，用稀释的特定一抗作用60分钟。为增强与一抗的结合，可以4℃作用过夜。
    
  • 去除一抗，用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5分钟。
    
  • 去除洗涤液，加入稀释的荧光标记的二抗避光孵育60分钟。
    
  • 回收荧光标记的二抗，用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5分钟，期间适当注意避光操作。
    
  • 滴一滴本试剂盒提供的抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上盖玻片，尽量避免气泡。
    
  • 如果一抗选用适当，在激光共聚焦显微镜下可以观察到远红外荧光。
• 对于组织切片：
  
  • 对于石蜡切片，需先完成脱蜡、水化和抗原修复。对于冰冻切片可以直接按照下面的步骤操作。
    
  • 用固定液固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。固定及后续的操作可以用百奥莱博的染色缸和染色架或邮寄夹进行操作。
    
  • 去固定液，用洗涤液洗3次，每次3～5分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。
    
  • 用封闭液封闭60分钟，可以在摇床上轻轻摇动。
    
  • 去封闭液，用稀释的特定一抗作用60分钟，可以在摇床上轻轻摇动。为增强与一抗的结合，可以4℃作用过夜。
    
  • 去除一抗，用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5分钟。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。
    
  • 去除洗涤液，加入1mL稀释好的荧光标记的二抗避光孵育60分钟，可以在摇床上轻轻摇动。
    
  • 回收荧光标记的二抗，用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5分钟，期间适当注意避光操作。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。
    
  • 滴一滴本试剂盒提供的抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上盖玻片，尽量避免气泡。
    
  • 如果一抗选用适当，在激光共聚焦显微镜下可以观察到远红外荧光。